Identificación de la estructura de TERRA en condiciones fisiológicas y en respuesta a estrés

La reciente identificación del locus TERRA llevada a cabo por nuestro grupo abre la posibilidad de entender el papel in vivo de TERRA, algo que todavía se desconoce. En ratón el locus principal se localiza en el cromosoma 18 mientras que en humano en el cromosoma 20q, denominando a los tránscritos que producen Chr18-TERRA y Chr20q-TERRA, respectivamente. Usando células KO para los Chr20q-TERRA nos permitió demostrar que los TERRA son esenciales para el mantenimiento telomérico y su protección (Antecedentes). Sin embargo, poco se conoce sobre la estructura de TERRA y cómo ésta determina su interacción con el telómero y con sus proteínas asociadas.

Para este objetivo se plantean varios hitos que se abordarán en colaboración con otros grupos del consorcio RyPSE:

• Hito 1. Determinar la estructura de TERRA tras la inducción de estrés.
• Hito 2. Determinar las proteínas que se unen a TERRA después de estrés y ver si la unión con éstas cambia la estructura de TERRA.
• Hito 3. Papel de los cuerpos nucleares en la estructura de TERRA y su respuesta a estrés.
• Hito 4. Estudio del papel antitumoral de los complejos de rutenio en el modelo murino de inducción de cáncer por c-myc y si está mediado por TERRA.

Análisis estructural y funcional de RNAs y proteínas que interaccionan con Gemin5

El control de la síntesis de proteínas es un mecanismo básico de homeostasis de respuesta rápida a señales intracelulares o ambientales. En este proceso intervienen proteínas de unión a RNA (RBPs) versátiles que modulan la traducción selectiva de mRNAs. La proteína Gemin5 regula la traducción mediante su interacción con el ribosoma, con elementos IRES o con su mRNA (Francisco-Velilla et al, 2018). Esta propiedad reside en sus dominios WD40, RBS1 y RBS2 (Figura 1). En este proyecto pretendemos descifrar la estructura tridimensional del motivo de unión a RNA no canónico RBS1, así como analizar motivos estructurales en RNAs.

Para este objetivo se plantean varios hitos que se abordarán en colaboración con otros grupos del consorcio RyPSE.

• Hito 1. Analizar la reactividad de RNAs hacia nuevos complejos dimetálicos (colaboración con grupo UCM).
• Hito 2. Caracterizar funcional y estructuralmente el motivo de unión a RNA no canónico de Gemin5 (colaboración con el grupo IQFR)
• Hito 3. Analizar la estructura de RNAs celulares que interaccionen con Gemin5 (colaboración con el grupo UCM, CNIO y IQFR)
• Hito 4. Estudiar cambios conformacionales en lncRNAs (colaboración con CNIO).

Estudio de los dominios intrínsecamente desestructurados de las proteínas Gemin5 y hnRNPA1 y sus interacciones con ácidos nucleicos y proteínas

Las proteínas de unión a RNA (RBPs) Gemin5 y hnRNP A1 poseen una organización característica compuesta por dominios de unión a RNA plegados y regiones intrínsecamente desestructuradas (IDD) (Figura 1). Ambas proteínas interaccionan con una gran variedad de RNAs a través de dominios específicos. En este proyecto estamos interesados en la interacción con el RNA de IRES virales y lnc TERRA celulares, y el papel que juegan las regiones IDD en este reconocimiento. Además, hnRNP A1 interacciona con elementos estructurales de genes antiapoptóticos cuya función como IRES celulares está por estudiar. 

Para este objetivo se plantean diferentes hitos que se abordarán en colaboración con otros grupos del consorcio RyPSE.

• Hito 1. Estudio por RMN de dominios intrínsecamente desestructurados (IDD) de Gemin5 y hnRNPA1
• Hito 2. Estudiar las interacciones de Gemin5 IDD con dominios RNA de IRES (En coordinación con el grupo CMBSO)
• Hito 3. Estudio por RMN de complejos entre hnRNP A1 y TERRA ( En coordinación con el grupo CNIO y CBMSO)
• Hito 4. Estudio de las interacciones entre hnRNP A1 y elementos estructurales del 5’UTRs de genes antiapoptóticos (con CBMSO y UCM)

Síntesis de compuestos de dirrutenio para la caracterización estructural de especies biológicas y como agentes anticancerígenos

Uno de los propósitos de este proyecto es la construcción de una librería de compuestos de dirrutenio(II,III) con capacidad para establecer enlaces con proteínas y distintos RNA y estudiar su potencial terapéutico.

Por esta razón, se han planteado los siguientes hitos que se están llevando a cabo en colaboración con los demás grupos del consorcio:

• Hito 1. Síntesis y caracterización de compuestos de dirrutenio
  • 1a. Compuestos open-paddlewheel del tipo [Ru₂Cl₂(L-L)₃]: El compuesto [Ru₂Cl₂(DPhF)₃(DMSO)] (DPhF^- = N,N-difenilformamidinato) distingue las zonas flexibles del RNA (ver figura). Se busca preparar compuestos similares pero con diferentes características electrónicas y estéricas, de manera que sean capaces de distinguir distintas zonas de plegamiento de los RNA

Representación esquemática de compuestos de dirrutenio con estructura paddlewheel (izq.) y open-paddlewheel (dcha.) Las posiciones reactivas del compuesto open-paddlewheel están marcadas con asterisco. B. Diagrama ORTEP de la estructura cristalina de [Ru₂Cl₂(µ-DPhF)₃(DMSO)]. Por claridad no se muestran los hidrógenos.

Lozano et al. RNA 22 (2016) 1-9.

• 1b. Compuestos paddlewheel del tipo [Ru₂Cl(O₂CR)₄]: Se pretende obtener compuestos solubles en medios acuosos y con ligandos que hayan mostrado actividad antitumoral. 

• Hito 2. Reactividad de compuestos de dirrutenio con especies biológicas
• 2a. Formación de complejos dirrutenio-proteína y caracterización mediante RMN.
• 2b. Estudio de la interacción de compuestos de dirrutenio con cadenas cortas de oligonucleótidos en lugar de RNA.